Удобное и высокоэффективное мультиплексное редактирование генома аутотетраплоидной люцерны

CRISPR/Cas9 — это мощный инструмент, который позволяет точно редактировать гены, и его применение в растительной биологии открывает новые горизонты для селекции и улучшения культур. Однако редактирование генома автотетраплоидной люцерны (Medicago sativa L.), одного из важнейших кормовых бобовых растений в мире, представляет собой значительную сложность. В данной работе описывается создание высокоэффективной системы редактирования генов для люцерны, включая выявление и оптимизацию промоторов, а также разработку мультиплексной системы редактирования.

Этап 1: Выявление эндогенных промоторов U6

Для начала исследования была проведена систематическая идентификация эндогенных промоторов U6 в люцерне. Этот процесс осуществлялся с использованием временной экспрессии, осуществляемой через Agrobacterium-опосредованную инфильтрацию листьев люцерны. Промоторы U6 являются важными элементами, так как они обеспечивают стабильную и высокоэффективную транскрипцию малых РНК, таких как sgRNA (single guide RNA), необходимых для работы системы CRISPR/Cas9.

Этап 2: Оценка эффективности промоторов

После выявления промоторов была проведена оценка их активности для редактирования генома. Для этого использовалась оптимизированная волосистая корневая система люцерны, что позволило исследовать эффективность трех наиболее активных промоторов. Волосистые корни служат удобной модельной системой для тестирования различных генетических конструкций, поскольку они легко поддаются трансформации и позволяют быстро оценивать результаты редактирования.

Этап 3: Создание мультиплексной системы CRISPR/Cas9

На следующем этапе была разработана улучшенная мультиплексная система CRISPR/Cas9, которая включает три или четыре тандемно расположенные кассеты экспрессии полицистронной тРНК-сгРНК (PTG), управляемые промотором MsU6. Каждая кассета состоит из трех единиц тРНК-сгРНК, что позволяет одновременно редактировать три или четыре гена люцерны.

Для визуальной селекции была добавлена репортерная система, использующая визуальные маркеры, такие как RH1 или RUBY. Эти маркеры позволяют легко отслеживать успешность трансформации и редактирования на ранних стадиях развития растений.

Этап 4: Результаты и их значение

Система продемонстрировала эффективное мультиплексное редактирование в волосатых корнях с возможностью визуальной селекции. В результате стабильной трансформации люцерны были получены регенерированные побеги, окрашенные в красный цвет, что указывает на успешное редактирование генов. Это является значительным достижением, так как визуальная репортерная система упрощает процесс селекции трансформированных растений и повышает эффективность работы.

Разработанная усовершенствованная мультиплексная система CRISPR/Cas9 предоставляет удобный и высокоэффективный инструмент для редактирования генома люцерны. Она может быть использована как в фундаментальных исследованиях, так и в генетическом улучшении растений, открывая новые возможности для функциональных исследований множества генов и семейств генов. Этот подход может значительно ускорить процесс селекции и улучшения люцерны, что, в свою очередь, окажет положительное влияние на сельское хозяйство и кормовую базу для животных.

Исследование: aBIOTECH