Цитогенетическая характеристика и разработка молекулярных маркеров новой дисомной линии пшеницы Thinopyrum ponticum 5E (5D) с устойчивостью к мучнистой росе и линейной ржавчине

Пшеница (Triticum aestivum L.) является одной из ключевых продовольственных культур, от которой зависит продовольственная безопасность во всем мире. Однако резкие изменения климата и рост народонаселения требуют постоянного увеличения валовой продуктивности этой культуры. Существенным лимитирующим фактором, снижающим урожайность и экономическую эффективность возделывания пшеницы, остаются грибные заболевания, в частности, мучнистая роса, вызываемая Blumeria graminis f. sp. Tritici, и линейная (стеблевая) ржавчина, возбудителем которой выступает Puccinia striiformis f. sp. Tritici.

Хотя для борьбы с этими патогенами широко используются фунгициды, их интенсивное применение сопряжено с экологическими рисками и не всегда является устойчивым решением. В этой связи особую ценность представляет использование генетического потенциала диких родичей пшеницы. Методы отдаленной гибридизации и хромосомной инженерии позволяют переносить полезные гены из третичного генофонда в культурную пшеницу, восполняя генетическое разнообразие, утраченное в процессе доместикации. Классическим примером является перенос гена Pm21 из Dasypyrum villosum, обеспечивающего высокую и длительную устойчивость к мучнистой росе, а также широкое использование транслокации 1RS·1BL. Однако способность патогенов преодолевать существующие гены устойчивости диктует необходимость непрерывного поиска и создания новой, более разнообразной зародышевой плазмы.

Thinopyrum ponticum является ценным донором для селекции, обладая множеством генов устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам. Ранее на основе этого вида были созданы различные аддитивные, замещающие и транслоцированные линии, демонстрирующие устойчивость к мучнистой росе и ржавчине. Однако, несмотря на значительный прогресс, создание и детальная характеристика новых дисомных линий замещения, несущих хромосомы Th. ponticum, и разработка специфических молекулярных маркеров для их ускоренного выявления остаются актуальными задачами. В частности, отсутствовали сообщения о разработке специфических маркеров для хромосомы 5E Th. ponticum на основе технологии секвенирования амплифицированных фрагментов специфических локусов (SLAF-seq).

Целью данной работы являлось создание и всесторонняя характеристика новой линии пшеницы с интрогрессией генетического материала Th. ponticum, обладающей высокой устойчивостью к мучнистой росе и линейной ржавчине, а также разработка молекулярных маркеров для идентификации чужеродного генетического материала.

Материалы и методы

Объектом исследования служила новая линия пшеницы CH97, выделенная из потомства от скрещивания мягкой пшеницы сорта 7182 с Th. ponticum с последующим возвратным скрещиванием. В работе использовали набор контрольных сортов пшеницы, а также виды-доноры геномов: Th. ponticum, Thinopyrum elongatum (геном Ee) и Pseudoroegneria spicata (геном St).

Цитогенетический анализ включал подсчет числа хромосом в корневых меристемах и изучение мейоза в материнских клетках пыльцы с использованием стандартных методов окрашивания. Для идентификации происхождения хромосом применяли методы молекулярной цитогенетики: геномную in situ гибридизацию (GISH) с тотальной ДНК Th. ponticum в качестве пробы, мультицветную GISH (mc-GISH) с использованием ДНК Th. elongatum и P. spicata для дифференциации субгеномов, а также неденатурирующую флуоресцентную in situ гибридизацию (ND-FISH) с олигонуклеотидными зондами для детального кариотипирования хромосом пшеницы и выявления структурных перестроек.

Для уточнения гомеологичной группы чужеродных хромосом использовали жидкостной микрочип GenoBaits®WheatplusEE, основанный на технологии таргетного захвата последовательностей Th. elongatum и пшеницы. Дополнительно проводили ПЦР-анализ с использованием микросателлитных маркеров (SSR) и маркеров PLUG, картированных на гомеологичные группы пшеницы.

Оценку устойчивости к болезням проводили в климатических камерах на стадии проростков с использованием доминирующего изолята мучнистой росы E09 и смеси рас линейной ржавчины CYR32 и CYR34, а также в полевых условиях на стадии взрослых растений в течение двух лет при естественном и искусственном заражении соответствующими патогенами. Тип инфекции оценивали по стандартным шкалам.

Агрономически важные признаки (высота растений, длина колоса, число колосков, число зерен, масса 1000 зерен и др.) анализировали в полевых опытах с использованием статистических методов.

Для разработки специфических молекулярных маркеров применяли технологию SLAF-seq. Проводили секвенирование геномов линии CH97 и Th. ponticum. Полученные риды, не имеющие гомологии с эталонным геномом пшеницы, но полностью совпадающие с последовательностями Th. ponticum, использовали для дизайна праймеров. Специфичность отобранных праймеров проверяли на ДНК родительской линии 7182, CH97 и Th. ponticum.

Результаты и обсуждение

Цитогенетическая стабильность и идентификация чужеродного материала

Цитогенетический анализ новой линии CH97 показал, что подавляющее большинство клеток корневой меристемы содержат 42 хромосомы, а в мейозе формируется 21 бивалент, при этом нарушений расхождения хромосом в анафазе не наблюдалось. Это свидетельствует о высокой цитологической стабильности и сбалансированном геноме линии.

Методом GISH было установлено, что CH97 содержит две чужеродные хромосомы Th. ponticum, в то время как остальные 40 хромосом происходят от пшеницы. Применение mc-GISH с субгеном-специфичными пробами позволило определить, что эти чужеродные хромосомы относятся к субгеному Ee (Th. elongatum). Детальный FISH-анализ с олигонуклеотидными зонами позволил не только идентифицировать все хромосомы пшеницы, но и выявить их структурные особенности. Было обнаружено, что в линии CH97 отсутствует пара хромосом 5D пшеницы, а вместо них присутствует пара чужеродных хромосом, несущих характерные сигналы. Кроме того, в кариотипе CH97 были обнаружены вариации в хромосомах 1B, 6B и 7B, а также наличие транслокации 1RS·1BL, что указывает на возможные спонтанные перестройки, вызванные процессом отдаленной гибридизации.

Результаты жидкостного микрочипирования полностью подтвердили данные in situ гибридизации. На хромосоме 5D пшеницы наблюдалось ослабление сигнала, в то время как на хромосоме 5E Th. elongatum было зафиксировано значительное обогащение последовательностями. Это окончательно подтвердило, что линия CH97 является дисомной линией замещения, в которой пара хромосом 5D пшеницы замещена парой гомологичных хромосом 5E, происходящих от Th. ponticum. Анализ с использованием молекулярных маркеров (SSR и PLUG), специфичных для пятой гомеологичной группы, дополнительно подтвердил наличие чужеродного материала, амплифицируя специфичные для Th. ponticum и CH97 фрагменты, которые отсутствовали у родительской линии 7182.

Оценка устойчивости к болезням и хозяйственно-ценных признаков

Фенотипическая оценка линии CH97 продемонстрировала ее высокую устойчивость к мучнистой росе и линейной ржавчине на всех этапах развития. На стадии проростков, в отличие от восприимчивых родительских форм, CH97 проявляла иммунитет или высокую устойчивость к использованным расам возбудителей. В полевых условиях на стадии взрослых растений линия CH97 также сохраняла устойчивость, в то время как сорт 7182 был сильно поражен болезнями. Полученные данные убедительно свидетельствуют о том, что гены, контролирующие устойчивость к обоим патогенам, локализованы на интродуцированной хромосоме 5E Th. ponticum.

Оценка агрономических показателей показала, что линия CH97 в целом сохранила морфотип родительского сорта 7182. При этом были выявлены как положительные, так и отрицательные изменения. К положительным признакам относятся достоверное увеличение массы 1000 зерен и длины зерна у CH97 по сравнению с родительской формой. Среди негативных изменений отмечено увеличение высоты растений и уменьшение числа колосков в колосе. Эти данные указывают на то, что интрогрессия хромосомы 5E, наряду с ценными генами устойчивости, может приводить к переносу и нежелательных аллелей, что требует дальнейшей селекционной работы по устранению этих недостатков.

Разработка специфических молекулярных маркеров

Для облегчения отслеживания хромосомы 5E Th. ponticum в селекционных программах были разработаны специфические молекулярные маркеры с использованием технологии SLAF-seq. Из общего числа идентифицированных фрагментов, специфичных для Th. ponticum, было отобрано 22 пары праймеров для проверки. В результате, девять маркеров показали стабильную и воспроизводимую амплификацию фрагментов, характерных как для Th. ponticum, так и для линии CH97, но отсутствующих у пшеницы 7182. Эффективность разработки специфичных маркеров составила 33,3%. Созданные маркеры представляют собой удобный и надежный инструмент для ускоренного скрининга и отбора линий пшеницы, несущих генетический материал хромосомы 5E Th. ponticum, что значительно повышает эффективность маркер-ориентированной селекции.

Заключение

В ходе данной работы была создана и всесторонне охарактеризована новая дисомная линия замещения пшеницы CH97, в которой хромосома 5D мягкой пшеницы замещена гомологичной хромосомой 5E, происходящей от Thinopyrum ponticum. Комплексный подход, включающий цитогенетический анализ, методы in situ гибридизации (GISH, mc-GISH, FISH), жидкостное микрочипирование и молекулярное маркирование, позволил точно определить происхождение и гомеологичную группу интродуцированных хромосом.

Установлено, что интрогрессия хромосомы 5E Th. ponticum обеспечивает линии CH97 высокую и стабильную устойчивость к мучнистой росе и линейной ржавчине на протяжении всего периода вегетации. Помимо ценных признаков устойчивости, линия характеризуется улучшенными показателями массы 1000 зерен и длины зерна по сравнению с исходной родительской формой.

С использованием технологии SLAF-seq были разработаны девять новых специфических молекулярных маркеров для идентификации хромосомы 5E Th. ponticum. Эти маркеры могут быть эффективно использованы в селекционных программах для ускоренного создания сортов пшеницы, сочетающих высокую продуктивность с комплексной устойчивостью к грибным заболеваниям. Линия CH97 представляет собой ценный исходный материал для генетических исследований, направленных на картирование генов устойчивости, и для дальнейшей селекционной работы по созданию транслоцированных линий с минимизацией негативного влияния чужеродного генетического материала на агрономически важные признаки.


Источник: Journal of Integrative Agriculture