Увеличить производительность оборудования для генетических исследований

Агрогенетика в России является драйвером развития как животноводства, в котором геномная селекция стала ключевым фактором формирования племенной ценности, оценки породности (и, соответственно, экономической эффективности животноводства), так и в растениеводстве, где Минсельхоз РФ оценивает вклад генетики и селекции в повышение урожайности примерно в 30–40%.

Одним из основных элементов генетических анализаторов и других систем капиллярного электрофореза является кварцевый капилляр, в котором происходит разделение заряженных частиц под действием электрического поля. Ресурс линейки капилляров составляет, как правило, около 200 анализов, далее качество электрофореза может начать снижаться. Капилляры, используемые для создания линеек (сборок), покрыты полиимидной защитной оболочкой для обеспечения механической прочности, при этом толщина кварцевых капилляров, используемых в системах капиллярного электрофореза, обычно составляет 100–500 мкм,в линейках одновременно используется от 1 до 24 капилляров. При формировании линеек необходимо локально удалять защитное покрытие с капилляров для обеспечения высокой оптической прозрачности в зоне детектирования. Разные способы очистки обеспечивают различную трудоемкость, длительность и качество очистки — все это влияет на эффективность работы лаборатории.

Институт аналитического приборостроения Российской академии наук— разработчик генетических анализаторов "Нанофор" 3-х поколений — провел две серии сравнительных исследований для определения эффективных способов удаления полиимида, а также разработал два вспомогательных устройства для удаления защитной оболочки.

1. ГАЗОВЫЕ ГОРЕЛКИ
Для удаления защитного покрытия широко используются газовые горелки, в частности бутановые — главным образом из-за невысокой стоимости оборудования и материалов. В сравнительном эксперименте для очистки капилляров бутаном рассматривались газовая горелка B-597 и водородная горелка (электролизная газосварочная установка "Лига-02С").

Максимальная температура пламени бутановой горелки составляет примерно 1300–1400 °С, что достаточно для деструкции полиимидного покрытия. Кислород в зоне горения полностью выгорает, в результате полиимидная оболочка под действием нагрева не сгорает, а карбонизируется. После обработки пламенем на поверхности капилляра образуется рыхлый черный слой на основе углерода и других продуктов деструкции полиимида. Для их удаления необходимо использовать механическую очистку при помощи специального ножа.

У этого метода есть недостатки:
- Капилляры — очень хрупкие, даже при незначительном усилии они могут ломаться. Кроме того, при механической очистке на капиллярах могут оставаться трещины и другие следы воздействия. Фоновое излучение в линейке капилляров в значительной степени определяется количеством центров рассеяния, которые формируются на дефектах капилляров. Величина фона, в свою очередь, определяет пороговую чувствительность геномного анализатора. Уровень фона линейки капилляров, изготовленных по традиционной технологии из капилляров, очищенных пламенем бутановой горелки, составляет 10 000–30 000 единиц.

поломка капилляра из-за увеличения хрупкости или чрезмерного усилия при механической очистке

оплавление защитной оболочки и дефекты от механической очистки

- Плохая воспроизводимость условий очистки, состава газовой смеси, температуры, равномерности нагрева и времени температурного воздействия также может приводить к появлению различных дефектов: неполному удалению защитной оболочки, неполной карбонизации полиимидной оболочки, деформации и оплавлению капилляров, появлению наплывов на краю защитной оболочки. Все это приводит к достаточно высокому проценту брака — примерно 10% от общего числа очищаемых капилляров.

неполное удаление защитной оболочки из-за недостаточной температуры или экспозиции

деформация капилляра из-за перегрева

- Есть и технологические ограничения.

1. Для очистки капилляров требуются специальные навыки и высокая концентрация внимания оператора. Одновременно можно очищать только один капилляр. На очистку одного капилляра уходит от 3 до 8 мин в зависимости от квалификации оператора.

2. Невозможность очистки капилляров в собранной линейке и автоматизации процесса очистки.

Достоинством использования бутановой горелки является невысокая стоимость расходных материалов и используемого оборудования.При помощи бутановой горелки в целом можно получить приемлемое качество очистки при мелкосерийном изготовлении капиллярных сборок. Однако использование бутановой горелки при крупносерийном производстве капиллярных сборок становится нецелесообразным из-за низкой производительности, необходимости дополнительной механической очистки, использования ручного труда и высокого уровня брака.

В качестве альтернативы быларассмотрена водородная горелка. В установке используется электрохимическое разделение воды на смесь водорода и кислорода. Для увеличения эффективности процесса электролиза в воду добавляют щелочь, которая не расходуется в процессе выработки газовой смеси. Установка позволяет получать давление водород-кислородной газовой смеси до 0.4 атм. Для удаления паров воды из газовой смеси служит охладитель-обогатитель, в ко-тором конденсируется избыточная влага. Кроме того, охладитель-обогатитель используется для введения в газовую смесь паров летучих углеводородов, таких как ацетон, бензол, этанол. Это позволяет контролировать характер пламени — от окислительного до восстановительного: в окислительном пламени имеется избыток кислорода, при этом цвет пламени желтый. В восстановительном пламени – недостаток кислорода, а цвет пламени бледно-голубой. Установка оснащалась специальным соплом с внутренним диаметром 0.5 мм, которое позволяло получить пламя необходимой мощности.Максимальная температура горения водородно-кислородной смеси составляет 2600 °С. Состав газовой смеси можно подобрать таким образом, чтобы пламя было окислительным, т.е. с избытком кислорода. Сочетание высокой температуры и наличия кислорода в зоне горения приводит к тому, что полиимидная оболочка на кварцевом капилляре сгорает полностью.

Можно отметить следующие отличия использования водородной горелки:

- Кварцевый капилляр после обработки не требует дополнительной механической очистки, что является существенным преимуществом по сравнению с бутановой горелкой.

- Фоновое излучение в линейке капилляров, очищенных при помощи водородной горелки, составляет примерно 10 000 единиц, что свидетельствует о хорошем качестве очистки. Ожидаемый уровень брака при использовании водородной горелки — не более 1%.

- Состав водородно-кислородной смеси является более стабильным, из-за чего воспроизводимость условий очистки более высокая. Однако более высокая температура водородного пламени по сравнению с бутановой горелкой может приводить к оплавлению и деформации самого кварцевого капилляра, поскольку температура размягчения кварца составляет 1400–1600 °С. Для того чтобы кварцевый капилляр не деформировался, температурное воздействие должно быть кратковременным — достаточным для удаления защитной оболочки, но недостаточным для размягчения кварцевого капилляра. Это требует от оператора высокой концентрации внимания. Для очистки одного капилляра требуется не более 1 мин. Одновременно можно очищать несколько капилляров.

- При использовании автоматизированной системы участие оператора сводится к укладке и последующему сбору очищенных капилляров. Режим сканирования задается и контролируется программой управления системой, температура обработки капилляров задается генератором водорода.

2. ЛАЗЕРНОЕ ИЗЛУЧЕНИЕ

Также было проведено сравнение очистки при помощи лазеров: ультрафиолетового и инфракрасного диапазона (СО2-лазера). Тестировалось инфракрасное (ИК) излучение СО2 лазера (λ = 10.6 мкм) и ультрафиолетовое (УФ) излучение (λ = 355 нм). Полиимидное покрытие полностью поглощает излучение с длиной волны короче 450 нм и пропускает излучение в диапазоне 500–850 нм. Полиимидное покрытие также поглощает излучение с длиной волны более 5.0 мкм. Поскольку на длине волны 10.6 мкм полиимид и кварц обладают высоким поглощением, удаление защитной оболочки происходит за счет термического нагрева материала оболочки и самого капилляра, что может приводить к появлению дефектов в процессе очистки.

Использование СО2-лазера является фактически термическим методом очистки, поскольку излучение этого лазера поглощается как полиимидом, так и кварцем. Использование этого лазера является привлекательным благодаря чистому источнику тепла и точному контролю температуры. Мощность лазерного излучения составляла 3.0 Вт, частота повторения импульсов лазерного излучения 5 кГц, скорость сканирования 100 мм/с.

Результаты очистки при помощи СО2-лазера:

- Удаление защитной оболочки капилляров происходило за счет нагрева и сгорания материала оболочки. Механической очистки после лазерной обработки не требовалось.

- Остатки полиимидной оболочки на очищенных участках капилляров отсутствуют.

- Очистка производилась путем вращения капилляра, поскольку кварц за счет своего поглощения не пропускал излучение на противоположную сторону. Это не позволяет одновременно очищать более одного капилляра.

Для минимизации нагрева капилляра было протестировано импульсное ультрафиолетовое лазерное излучение с длиной волны λ = 355 нм. Излучение с такой длиной волны хорошо поглощается полиимидным защитным покрытием и практически не поглощается кварцем, что позволяет удалять защитное покрытие через кварцевый капилляр, не вращая его. Использование коротких лазерных импульсов позволяет реализовать режим лазерной абляции: нагрев происходит только в защитной оболочке, а сердцевина кварцевого капилляра не успевает нагреваться из-за различной теплопроводности материала.

Математически была определена необходимая плотность мощности лазерного излучения. Из полученных численных оценок следует, что для эффективного удаления защитного покрытия с кварцевого капилляра при разумной фокусировке лазерного луча в пятно диаметром 50–100 мкм и частотах следования импульсов 50–100 кГц достаточно использовать лазерный источник с пиковой мощностью 1–5 Вт.

В экспериментальной реализации метода с минимальным нагревом капилляра использовалось УФ-лазерное излучение с длиной волны 355 нм со следующими параметрами: длительность импульса τ = 20 нс, частота следования импульсов 50 кГц, диаметр пятна 40 мкм, максимальная мощность лазера 3 Вт.Из очищенных УФ-лазером капилляров была собрана пробная линейка капилляров и проведено тестирование на приборе "Нанофор 05". Фоновое излучение в ЛК, изготовленной из капилляров, очищенных при помощи УФ-лазера, составило примерно 20 000 единиц.Уровень появления дефектов при лазерной очистке капилляров — менее 1.0%,

Капилляр, очищенный при помощи УФ лазера

К достоинствам лазерной технологии удаления защитной полиимидной оболочки с кварцевых капилляров при помощи УФ-лазерного излучения следует отнести:
- Хорошую воспроизводимость условий очистки благодаря высокой стабильности лазерных параметров.
- Низкий ожидаемый уровень дефектов капилляров как следствие высокой стабильности условий очистки и отсутствия субъективного фактора при выборе оптимального режима.
- Очистка производится в режиме холодной абляции — без заметного нагрева капилляра и термических деформаций, поскольку для очистки используются короткие импульсы и ультрафиолет не поглощается кварцем.
- В процессе очистки происходит полное удаление полиимидной защитной оболочки, механическая очистка капилляра не требуется, отсутствует риск механического повреждения капилляра.
- Высокая скорость очистки: для одновременной очистки 100 капилляров потребуется около 1 мин, что существенно меньше, чем при использовании для очистки капилляров пламени горелки (от 5 до 13 ч).
- Лазерная очистка обладает высокой технологичностью. Переход на другие типоразмеры капилляров практически не повлияет на режимы очистки и ее скорость.
- Лазерная очистка УФ-излучением позволяет производить обработку линейки капилляров без ее вращения.
- Участие оператора в процессе очистки сводится к укладыванию капилляров на предметном столе и сбору капилляров после очистки. Лазерную очистку можно легко автоматизировать. В процессе очистки капилляров производится объективный контроль качества очистки.
- Лазерная очистка не требует никаких расходных материалов.

Лазерная очистка является более безопасной технологией по сравнению с очисткой при помощи газовой горелки. Лазерная установка может быть оборудована локальной вытяжкой и системой отведения продуктов разложения. Оператор находится вне зоны очистки. Оператор не контактирует с токсичными продуктами разложения полиимида и лазерным излучением. Технология является пожаробезопасной.

Таким образом, в зависимости от требуемого количества капилляров за единицу времени, приемлемого качества очистки, имеющегося оборудования, владелец секвенатора или другого прибора на основе капиллярного электрофореза может выбрать подходящую технологию внешней очистки капилляров.

3. ФИКСАТОРЫ КАПИЛЛЯРОВ

Для удобства удаления защитной оболочки ИАП РАН разработал два фиксатора кварцевых капилляров.

Первый фиксатор состоит из ложемента для укладки капилляров и крышки для фиксации капилляров в ложементе. Ложемент и крышка имеют взаимосогласованные V-образные (в профиль) продольные структуры для фиксации капилляров и сквозные отверстия для обеспечения доступа к ним: через эти отверстия пламя газовой горелки или лазерное излучение направляется на очищаемые капилляры.

Ложемент и крышка могут иметь сквозные отверстия для взаимного крепления при помощи, например, винтовых соединений. Ложемент и крышка могут быть выполнены из разных материалов: металла, керамики или другого термостойкого материала. Для очистки капилляров может использоваться газовая горелка, лазерное излучение, термический нагрев в муфельной печи.

Второй фиксатор включает в себя основание и две стойки (как вариант, с установленными в них гильзами). В гильзах имеются сквозные отверстия, в которые вставляется очищаемый кварцевый капилляр. Расстояние между гильзами определяет зону очистки капилляра. Основание, стойки и гильзы могут быть выполнены из термостойкого металла, керамики или из другого термостойкого материала. Диаметр сквозных отверстий в гильзах определяется диаметром очищаемых капилляров и может составлять от 0.5 до 3 мм. Для очистки капилляров также может использоваться газовая горелка, лазерное излучение, термический нагрев в муфельной печи.



Использование обоих устройств фиксации позволило значительно повысить качество и скорость очистки капилляров от защитной оболочки.